白藜芦醇对HCV增殖影响的研究!

HCV感染是日益受到关注的全球公共卫生问题,是慢性肝脏疾病的主要病因之一。

 近1.3-1.7亿的人口是慢性HCV感染者,占世界人口的2-3%。慢性HCV感染者,20年后进展为肝硬化的概率为4-24%,30年后罹患原发性肝癌的概率为1–3%。HCV治疗随着对HCV基因组和分子病毒学领域的深入研究而取得了新的进展,HCV蛋白酶抑制剂(DAA)的出现更是将该领域的研究推向巅峰。

自2011年9种DAA药物的上市,在HCV治疗上,获得高达≥90%持续的病毒学应答率(SVR)突破性的进展,且有较小的副作用;然而,高额的治疗费用仍是限制大多数新兴的DAA药物应用的重要因素,大部分急需治疗的患者不能及时用药导致病毒清除的失败。

虽然在过去的10余年,HCV感染的治疗取得了很多突破性的进展,但目前仍未有获得审批的疫苗,同时DAA药物的高额费用限制了DAA药物的使用,这使新的治疗手段的开发尤为必要。

白藜芦醇(RVT)是一种存在于多种植物及水果中的多酚类化合物。研究表明,这种酚类合成物是长寿基因(sirtuin)的强效激活剂,该基因与寿命的长短有关,同时被认为是饮用红酒时产生多酚类化合物中最为有益的成分,也被称为:法国悖论(法国人酷爱美食,平时饮食中摄取大量高卡路里和高胆固醇的食物,但得心血管疾病的几率却比英语国家的人要低得多)。

多酚白藜芦醇分子中含有亚甲基桥隔开的两个苯环的分子,是第一个发现能够通过刺激的SIRT分泌发挥作用。Sirtuins1-7(SIRT1-7)属于第三类脱乙酰基酶,它依赖于NAD+的发挥活化作用。 SIRT可以参与基因抑制,代谢控制,细胞凋亡和细胞存活,DNA修复,神经保护和老龄化等调节作用。到目前为止研究最广泛的一直是SIRT1。 AMPK和SIRT1是构成RVT的两个关键指标。RVT可以抑制线粒体ATP生产,导致了更高的AMP/ATP比和AMPK的LKB1依赖性活化。然后,AMPK可以提高NAD+供应,该辅因子能够提高SIRT1的酶活性,从而改善速率限制。

本研究的目的旨在探讨白藜芦醇对HCV繁殖周期的影响。据报道,白藜芦醇有抗肿瘤、抗炎症、抑制肥胖以及抗细菌的特性,同时又具有保护心血管系统的功能。白藜芦醇在非酒精性肝脏疾病中具有升高炎症因子的作用。此外,前期研究表明白藜芦醇可以抑制人类巨细胞病毒(HCMV)、单纯疱疹病毒(HSV-1)、水痘-带状疱疹病毒和甲型流感病毒的复制。 在本研究中使用huh7.5.1细胞系来完成实验,首先对白藜芦醇的细胞毒性进行评价,在两个细胞培养基中分别加0ug/ml、1ug/ml、3ug/ml、5ug/ml、6ug/ml、7ug/ml、8ug/ml、10ug/ml、13ug/ml,其中一个培养基培养48h、另一个培养96h,之后用MTT试剂盒检测细胞活性,发现0-5ug/ml时,细胞大多数都有活性,然而6-13ug/ml时细胞死亡明显,因此白藜芦醇通过评价,最终选择出没有细胞毒性的剂量。

本实验通过检测细胞培养衍生的HCV颗粒(HCVcc)中的JCR-2a进行研究,JCR-2a是一种新颖的单顺反子海肾荧光素酶受体病毒,这种病毒是通过HCV2a型转染质粒Jc1后得到。JCR-2a标记的HCV颗粒可以在体外存在,因此,是一种广泛使用丙型肝炎病毒完整的复制周期模型。首先,将JCR-2a转染细胞,4h后加不同浓度(0、1、3、5ug/ml)的白藜芦醇,继续培养72h,向细胞培养基中加底物(底物和单顺反子海肾荧光素酶结合后会发出荧光),检测荧光强度进行分析细胞内JCR-2a复制情况,实验发现四组中无明显差异。其次,提取上述实验过程中的上清液体(内含有白藜芦醇和JCR-2a),并分别将上清液体感染新的Huh7.5.1细胞系,培养72h,加入底物检测荧光强度,发现四组有明显差异,白藜芦醇浓度越高,越容易影响病毒对细胞的感染能力。

由于以上实验不能明确白藜芦醇对于细胞释放HCV的影响,设计了下一步实验,选择Jc1病毒转染Huh7.5.1细胞系,4h后加不同浓度的白藜芦醇(0ug/ml、1ug/ml、3ug/ml、5ug/ml),继续培养48h,用ELISA的方法检测细胞内和细胞外的丙肝病毒核心蛋白,发现四组中细胞内和细胞外没有明显影响。同时应用Western blot检测细胞内的丙肝病毒核心蛋白,实验数据表明四组无明显影响。

再次,为了进一步证实白藜芦醇对病毒进入细胞的影响,第一部分:将不同浓度的白藜芦醇(0ug/ml、1ug/ml、3ug/ml、5ug/ml)加入培养Huh7.5.1细胞的培养基4h后,去除上清中白藜芦醇,向内加入JCR-2a,培养4h后去除上清,加入新的培养液继续培养48h,检测荧光强度无明显影响。第二部分:将不同浓度的白藜芦醇(0ug/ml、1ug/ml、3ug/ml、5ug/ml)和JCR-2a同时加入培养Huh7.5.1细胞的培养基4h后,去除上清中白藜芦醇和JCR-2a,加入新的培养液继续培养48h,检测荧光强度发现影响明显。第三部分,先加JCR-2a加入培养基中培养4h,去除上清液,将不同浓度的白藜芦醇(0ug/ml、1ug/ml、3ug/ml、5ug/ml)加入培养Huh7.5.1细胞的培养基48h后,检测荧光强度发现无影响。最后,本实验中选择了一个新的细胞系Huh7.5.1-VISI,该细胞系感染病毒后会发出绿色荧光。将JCR-2a转染Huh7.5.1-VISI细胞系,培养4H后去除上清,向内加入琼脂糖凝胶72h后用荧光显微镜观察空斑,然后去除琼脂糖凝胶,用NS5A抗体进行染色,用普通显微镜计数空斑个数。

各种实验数据表明,白藜芦醇可以通过损害病毒进入靶细胞的能力来抑制丙肝病毒复制,但对HCV RNA的翻译或复制没有影响,我们还通过ELISA的方法进一步证实白藜芦醇对丙肝病毒核心蛋白的装配和释放没有影响。丙肝病毒感染细胞是一个复杂的多步骤过程,涉及至少4种细胞因子(CD81, SR-B1, claudin-1occludin)。丙肝病毒的入侵、扩散和繁殖在丙肝病毒感染中起重要作用,这也是丙肝治疗的指征。

另外实验表明,通过白藜芦醇预处理的Huh7.5.1细胞并不影响HCV的感染过程。另一方面,我们通过用最大有效剂量白藜芦醇和病毒进行同时处理该细胞系,结果证实了白藜芦醇抑制HCV是通过损害病毒进入靶细胞的过程。……

[关键词]: 丙型肝炎病毒白藜芦醇抗病毒

[文献类型]:硕士论文

[文献出处]:吉林大学

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#白藜芦醇 #HCV  #抗病毒

 

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