改善神经保护和神经功能作用的丝素肽及其制备方法
申请号 : CN200480044137.1
文献号 : CN101163712B
文献日 : 2012-04-25
发明人 : 金圣秀 , 姜勇求 , 朴哲炯 , 李相炯 , 朱完锡 , 李元福 , 菜嬉善 , 罗惠敬
申请人 : 脑保护株式会社
关键词 :
bg101 神经 细胞 多巴胺 蛋白 缺血 神经细胞 bf 胆碱 乙酰胆碱
摘要 :
本发明涉及具有神经保护和神经功能活性的丝素肽及其制备方法，并且更具体地涉及一种通过丝纤蛋白的水解制备优选具有神经保护活性的200～100,000重均分子量的丝蛋白的方法；一种包括丝素肽和药学上可接受的载体的用于预防或治疗脑疾病的组合物；以及一种用于改善脑功能的组合物。
权利要求 :
1.重均分子量为200～15,000的丝素肽在制备用于恢复患有脑紊乱的受试者的受损伤的脑功能或改善正常受试者的脑功能的食品组合物的用途，其中所述脑紊乱为帕金森氏病或脑缺血，所述脑功能为记忆或学习能力。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述丝素肽通过水解丝纤蛋白制备。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述丝素肽是通过使用钙盐溶液水解、酸水解、使用蛋白酶水解或其组合制备的。
4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述蛋白酶选自包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、高温蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶protamex和其混合物的组。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述蛋白酶选自包括高温蛋白酶、风味蛋白酶和其组合的组。
6.根据权利要求3所述的用途，其中，所述丝素肽具有200～4,000的重均分子量，并且是通过依次进行(i)使用钙盐溶液水解，和(ii)使用选自包括高温蛋白酶、风味蛋白酶和其组合的组的蛋白酶的水解制备的。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述丝素肽具有200～1,200的重均分子量。
8.根据权利要求6所述的用途，其中，所述钙盐为氯化钙。
9.根据权利要求1所述的用途，其中，所述丝素肽通过酸水解制备，且具有200～
15,000的重均分子量。
10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述丝素肽具有200～3,000的重均分子量。
11.根据权利要求10所述的用途，其中，所述丝素肽具有200～1,500的重均分子量。
12.根据权利要求1所述的用途，其中，所述丝素肽具有神经保护活性。
13.根据权利要求12所述的用途，其中，所述神经保护活性是通过抑制神经细胞死亡实现的。
14.根据权利要求13所述的用途，其中，所述抑制神经细胞死亡是通过抑制神经细胞凋亡实现的。
15.根据权利要求14所述的用途，其中，所述抑制神经细胞凋亡是通过抑制半胱天冬酶的活性实现的。
说明书 :
改善神经保护和神经功能作用的丝素肽及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及具有神经保护和改善脑功能作用的丝素肽(silkpeptide)，及其制备方法。更具体而言，本发明涉及一种通过丝纤蛋白的水解制备优选具有神经保护活性且具有200～100,000重均分子量的丝蛋白的方法；一种包括丝素肽和药学上可接受的载体的用于预防或治疗脑疾病的的组合物；以及一种用于改善脑功能的组合物。
背景技术
[0002] 在韩国排名最高的死亡原因的大脑卒中(或中风)指一种由脑中血管的破裂或阻塞引起的脑疾病，并导致一些脑组织失常。因为由工业化和医学科学的发展引起寿命的延长，由上述疾病引起的死亡率在上涨。中风可能在身体的任何部分发生，并相应地引起该部分的功能失调。医学上，将中风分成“缺血性发作”和“出血性卒中”，并且与高血压和动脉硬化更密切相关的前者表现出相对更高的复发率。
[0003] 缺血性发作是由从颈(即颈动脉)周围的任何血管到脑中的任何血管的阻塞引起的。其结果，出现脑梗塞，且该区域的功能可能不会恢复成良好。所以，治疗中风中最重要的事情是预防脑缺血本身，连同预防如高血压、糖尿病和升高的血脂水平的危险因子。 [0004] 目前用于神经保护的物质的例子为如神经节苷脂(ganglioside)和尼莫地平的兴奋性氨基酸拮抗剂，和如氯甲噻唑(clomethiazole)的GABA激动剂。硫酸镁和甘氨酸拮抗剂处于2期临床试验，并且正在进行关于吡拉西坦(piracetam)的大规模临床试验。然而，常规神经保护剂主要 是针对作用于缺血发展中的每个阶段，所以仍然需要开发出作用于许多阶段，同时具有很少的副作用和药物并发症的复合剂。而且，可以稳定地预防缺血和防止缺血后神经细胞凋亡的功能性食品，已经被认为对于预防缺血性发作比药物本身更有效。
[0005] 美国专利号6,245,757公开了黄体酮用于治疗由缺血引起的细胞损伤的用途。美国专利号6,380,193公开了一种包括聚(腺苷5′-二磷酸-核糖)聚合酶抑制剂的用于治疗中风的药物组合物。同样，美国专利号6,288,041公开了一种包括唾液酸衍生物的用于治疗中风的药物组合物。
[0006] 帕金森氏病(PD)是一种可以引起运动和智力损伤的神经退化性疾病，并被James Parkinson在1817年首次报道。在美国，该疾病的发病率为约每100,000人有100～150人。目前患者的数量为约750,000～1,000,000，并且每年约有60,000新患者加入到该行列中。考虑到全球老年化社会的趋势，其发病率在韩国也会增加。在组织病理学上，PD引起黑质中多巴胺神经细胞的损耗，以及尾状核和豆状核中多巴胺的减少，继之以运动或智力的损伤，如震颤、运动过慢、强直和姿势障碍(disturbance of posture)。 [0007] 已经使用能够补充脑中多巴胺的功能、或者能够预防或延迟神经细胞的破坏、或能够控制如抑郁的伴随症状的药物治疗帕金森氏病。这些药物的例子为美多巴(左旋多巴、L-多巴，多巴胺前体)、bromidine(多巴胺受体激动剂)、麦角乙脲(lisuride)、苯海索(抗乙酰胆碱药)和苯扎托品(cogentin)。在这些药物中，已知左旋多巴在通过补充脑中的多巴胺浓度治疗帕金森氏病上是最有效的。然而，当服用超过3～5年时，左旋多巴表现出副作用，如缩短的有效时间(逐渐减弱)，或运 动控制功能的较大波动(时断时续现象)，和异常的运动症状(运动障碍)(Freed等人，N.Engl.J.Med.327：1549-55(1992))。 [0008] 而且，还使用了用于帕金森氏病的外科治疗，且其例子为丘脑切开术、苍白球切开术、深部脑刺激术和神经细胞移植术。然而，有效性的持续时间与严重的副作用，如伴随手术的发音过弱、构音障碍、记忆力下降，在患者之间明显不同(Ondo等人，Neurology50：266-270(1998)；Shannon等人，Neurology50：434-438(1998))。
[0009] 阿耳茨海默氏病的治疗目前集中在阿耳茨海默氏病可能是由大脑皮层和海马中受损的胆碱能信号和传递引起的事实(Bartus等人，Science.217(4588)：408-14(1982)；Coyle等人，Science.209(4589)：1184-90(1983))。由于脑中该区域与记忆力和智力有关，在该区域的功能缺陷可能引起记忆力和智力的丧失。尽管神经信号损伤的过程仍然是有争议的，但老年斑和神经原纤维缠结(NFT)被认为是主要原因。由淀粉样蛋白β(Aβ)的累积造成的老年斑为该疾病的显著特征，并且可以通过尸体剖检证实阿耳茨海默氏病(Khachaturian，Arch.Neurol.42(11)：1097-105(1985))。
[0010] 作为治疗阿耳茨海默氏病的方法，提供了增加或维持乙酰胆碱量以抑制胆碱能信号的损伤，或引起乙酰胆碱更有效地作用于神经细胞的传递的方法。所以，阿耳茨海默氏病的患者使用提高乙酰胆碱活性的化合物。最有效的方法是快速分解突触中的乙酰胆碱，从而抑制乙酰胆碱酯酶的活性，这些抑制剂(如他克林(tacrine)、多奈哌齐(donepezil)和雷发斯的明(rivastigmine))已被KFDA批准，且目前已上市。尽管其在防止疾病的进一步破坏性发展上有作用，但是其不能用于使患者恢复到病前水平。
[0011] 一些化合物针对改善神经状态和维持老化细胞良好的功能。例如，NGF或雌激素作为神经保护剂以延迟神经退化，和抗氧化剂减少由细胞氧化引起的损伤。当淀粉样蛋白β肽蓄积在神经炎空间时阿耳茨海默氏病变得严重，并且淀粉样蛋白前体蛋白(APP)被认为与如α-、β-和γ-分泌酶的细胞中的蛋白酶结合起作用。然而，淀粉样蛋白β形成的过程，不可能控制淀粉样蛋白β的形成。
[0012] 不确定淀粉样蛋白β的蓄积如何作用于神经传递。异常核裂的APP诱发产生淀粉样蛋白β，并且由淀粉样蛋白β的蓄积诱发产生斑点。因此，多种作用于分裂反应的因素(如炎症反应)增加了微管相关蛋白的磷酸化反应，并且还增加了与NFT结合的配对螺旋样纤维(PHF)的蓄积，从而导致神经变性和最终成为阿耳茨海默型痴呆。
[0013] 直到最近，阿耳茨海默氏病的治疗只是集中在改善症状，而不是集中在恢复疾病的过程。
[0014] 美国专利号5,532,219公开了一种包括4，4′-二氨基二苯基砜的用于治疗阿耳茨海默氏病的药物组合物。美国专利号5,506,097公开了一种包括对脒基苯基甲烷磺酰氟或抑脂酶免疫酮A的用于治疗阿耳茨海默氏病的药物组合物。美国专利号6,136,861公开了一种包括双环[2.2.1]庚烷的药物组合物。
[0015] 同时，在现代社会中，压力正在成为健康的主要问题，并且据报道在韩国，1/3二十几岁的人通常经受很多压力，并且在其青少年时女性经受压力比男性的多。压力的强度取决于个性、兴趣、释放压力的方式、周围环境、个体的控制能力，并且压力通常继之以抑郁。抑郁可以导致自杀，并且由于其发生率和复发率较高，所以被认为是非常 重要的病症。已报道抑郁是由如肾上腺素、多巴胺或5-羟色胺的神经递质的减少引起的，并且继之以脑损伤。尽管三环类抗抑郁药(TAC)，特别是阿米替林(amitriptyline)，为众所周知的疗法，但是其具有多种副作用的缺点。氟西汀，于二十世纪八十年代在美国开发的选择性5-羟色胺再吸收抑制剂(SSRI)，由于其克服了TAC的问题并提高了药物顺应性，所以在20个世界药物中排名第7。但是，与TAC相比，SSRI在效能上表现出很小的增加，并且仍具有严重的药物干扰。
[0016] 另外，压力也诱发神经紊乱，并且没有办法抑制抑郁药物治疗后的复发，所以目前只能使用低剂量的长期用药。因此，开发具有优良的抑制神经细胞凋亡和调整神经传递系统的活性的物质是非常重要的。而且，由于考虑到避免拜访治疗机构以及忽视诱发5-羟色胺神经系统紊乱和脑损伤的趋势，开发具有抗抑郁活性的功能性食品也是重要的。 [0017] 作为开发用于预防和治疗神经退化性疾病的药物的尝试的代表性实例，美国专利号6,020,127公开了从人染色体5q13得到的抑制神经细胞凋亡的基因编码蛋白，并且美国专利号6,288,089公开了通过抑制多巴胺神经细胞的凋亡治疗神经退化性疾病的吡啶基咪唑。
[0018] 贯穿本说明书引用了论文和专利，并且参考文献示于圆括号中。论文和专利在此以全文引用作为参考，用于更好地理解相关技术的水平和本发明的要点。
[0019] 本发明人已进行了深入的研究和试验，并最终发现由具有一定重均分子量范围的丝蛋白水解制得的丝素肽具有优异的如预防或治疗脑疾病的神经保护活性，并且改善多种脑功能指标，从而完成了本发明。
[0020] 所以，本发明的目的是提供一种制备具有神经保护活性的丝素肽的方法。 [0021] 本发明的另一目的是提供一种用于预防或治疗脑疾病的药物组合物。 [0022] 本发明的又一目的是提供一种用于预防或治疗脑疾病的食品组合物。 [0023] 本发明的再一目的是一种提供用于改善脑功能的药物组合物。
[0024] 本发明的另一目的是提供一种用于改善脑功能的功能性食品组合物。 [0025] 通过参考以下的详细描述和附图，可以更好地理解本发明的其它目的或优点。 发明内容
[0026] 在本发明的一个技术方案中，提供了一种通过进行丝蛋白的水解制备具有200～100,000重均分子量且具有神经保护活性的丝素肽的方法。
[0027] 在本发明的另一个技术方案中，提供了一种用于预防或治疗脑疾病的药物组合物，其包括(a)由丝蛋白的分解制备的药学上有效量的丝素肽，和(b)药学上可接受的载体。
[0028] 在本发明的又一个技术方案中，提供了一种用于预防或治疗脑疾病的食品组合物，该组合物包括由丝蛋白的水解制备的丝素肽作为活性成分。
[0029] 在本发明的进一步的技术方案中，提供了一种用于改善脑功能的药物组合物，其包括(a)由丝蛋白的水解制备的药学上有效量的丝素肽，和(b)药学上可接受的载体。 [0030] 在本发明的再一个技术方案中，提供了一种用于改善脑功能的食品组合物，其包括由丝蛋白的水解制备的丝素肽作为活性成分。
[0031] 在本发明中，丝蛋白被用作起始物料。如此处所用的，术语“丝”指由蚕产生的丝，特别是由家蚕的幼虫在形成茧的过程中产生的丝，其中幼虫在蛹阶段过程中被包围在茧中。
[0032] 丝蛋白包括约75％的丝纤蛋白和约25％的丝胶蛋白，并且丝纤蛋白和丝胶蛋白在这里被作为丝素肽的原料使用。丝纤蛋白包含大量的甘氨酸和丙氨酸，而丝胶蛋白具有多于三分之一的丝氨酸，表现出与丝纤蛋白完全不同的含量。根据最近的报道，丝纤蛋白为以6：6：1的摩尔比包含H-链(350kDa)、L-链(26kDa)和糖蛋白P25(30kDa)的2.3BG101a的大蛋白，其中H-链与L-链形成S-S键联，而P25通过非共价键与这些链连接。由于这种结构，丝纤蛋白作用就像具有微晶区和非微晶区的交替层的聚合物一样。
[0033] 在优选实施方式中，丝蛋白为丝纤蛋白。
[0034] 在优选实施方式中，丝蛋白的分解是通过进行选自包括(i)在钙盐溶液中的分解，(ii)酸水解，(iii)酶水解，和(iv)其组合的组的非限制反应完成的。这样制备的丝素肽具有200～100,000的重均分子量。
[0035] 在更优选的实施方式中，丝蛋白的分解是通过进行(i)在钙盐溶液中的分解，和随后(ii)蛋白酶水解完成的。而且，丝蛋白的分解优选包括以下步骤：(a)将丝纤蛋白溶于包含钙盐的溶液，(b)从该溶液中除去钙盐，(c)(flavourzyme)和糖化酶(sumizyme)的混合物，从而制得具有200～2,000重均分子量的丝素肽。
[0036] CaCl2·乙醇通常被用作钙盐溶液中分解(i)的钙盐。步骤(a)优选在60～95℃，更优选在70～95℃，最优选在85～90℃下，通过将丝纤蛋白溶于包含氯化钙、水和乙醇的溶液中进行。步骤(b)可以通过使用多种如凝胶过滤色谱法的常规方法进行。步骤(c)优选在45～60℃，更优选在50～60℃，最优选在约55℃下进行。这样制备的丝素肽具有25,000～50,000相对较高的重均分子量，并且由于其低体内吸收，不适于食品和药品，但其仍可用于化妆品。由(ii)酸水解制备的丝素肽具有200～10,000的重均分子量。尽管可以使用多种酸，但优选强无机酸，更优选盐酸。反应(ii)的温度优选为70～120℃，更优选为90～110℃，且最优选为110℃。反应(ii)具有可制得低分子量肽的优点，但是其难于适当地控制分子量范围。在一个实施方式中，酸水解(ii)包括以下步骤：(a)在70～
120℃下于盐酸溶液中进行水解，(b)通过向水解溶液中加入碱性溶液提高pH值，和(c)除去步骤(b)中产生的盐，从而制得具有200～3,000重均分子量的丝素肽。最优选地，这样制备的丝素肽具有200～1,500的重均分子量。步骤(b)中使用的最合适的碱性溶液为氢氧化钠溶液。如凝胶渗透色谱法的多种方法可用于步骤(c)。另外，由酸水解制备的肽在水中基本上具有100％的溶解度，而其在如乙醇、甲醇、丙酮和二甲基甲酰胺的有机溶剂中表现出非常低的溶解度。
120℃下于盐酸溶液中进行水解，(b)通过向水解溶液中加入碱性溶液提高pH值，和(c)除去步骤(b)中产生的盐，从而制得具有200～3,000重均分子量的丝素肽。最优选地，这样制备的丝素肽具有200～1,500的重均分子量。步骤(b)中使用的最合适的碱性溶液为氢氧化钠溶液。如凝胶渗透色谱法的多种方法可用于步骤(c)。另外，由酸水解制备的肽在水中基本上具有100％的溶解度，而其在如乙醇、甲醇、丙酮和二甲基甲酰胺的有机溶剂中表现出非常低的溶解度。
[0037] 前面提到的酶水解是通过使用蛋白酶进行的。优选地，蛋白酶水解是任意通过使用序列非特异性蛋白酶进行的。蛋白酶的代表性实例包括但不限于胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶(alcalase)、高温蛋白酶(thermoase)、风味蛋白酶、糖化酶、复合蛋白酶(protamex)和肌球吸附蛋白。在优选实施方式中，此处使用的酶为高温蛋白酶、风味蛋白酶、糖化酶或其混合物。
[0038] 在(iv)组合反应的情况下，丝纤蛋白的分解是通过依次进行(i)钙盐分解，或者弱酸或碱水解和(ii)酶水解完成的。优选地，丝纤蛋白的分解是通过依次进行(i)钙盐分解，和(ii)高温蛋白酶、风味蛋白酶、糖化酶、和其混合物水解完成的。这样制备的丝素肽具有200～15,000，优选200～4,000，更优选200～2,000，且最优选200～1,200的重均分子量。该丝素肽在水中基本上具有100％的溶解度，而在如乙醇、甲醇、丙酮和二甲基甲酰胺的有机溶剂中表现出非常低的溶解度。在最优选的实施方式中，丝纤蛋白的分解包括以下步骤：(a)将丝纤蛋白溶于包含钙盐的溶液，(b)从该溶液中除去钙盐，(c)加入风味蛋白酶和糖化酶的混合物。
[0039] 这里优选的肽为(a)使用丝纤蛋白作为底物通过水解制备的一种肽；和(b)使用丝纤蛋白作为底物通过依次进行钙盐分解和选自包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、高温蛋白酶、风味蛋白酶、糖化酶和其混合物的组的酶分解制备的一种肽。最优选的肽为(c)使用丝纤蛋白作为底物通过进行钙盐分解和随后选自包括高温蛋白酶、风味蛋白酶、糖化酶和其混合物的组的酶分解制备的一种肽。
[0040] 这里包括丝素肽的组合物主要由于其神经保护活性(即对于神经细胞的保护活性)，所以具有预防或治疗脑疾病的活性。如这里所用的，术语“神经细胞”包括中枢神经系统、脑、脑干、脊髓、具有连接中枢神经系统和周围神经系统的结构的神经细胞、和神经支持细胞、神经胶质细胞和神经鞘细胞。如这里所用的，术语“神经保护活性”或“对于神经细胞的保护活性”指减少或改善神经损伤，和保护或恢复已遭受神 经损伤的神经细胞的作用。如这里所用的，术语“神经损伤”指由如代谢、中毒、神经中毒和化学原因的各种原因引起的对神经细胞或组织的任何损伤。
[0041] 此处组合物可以应用的病症的代表性实例包括但不限于神经退化性疾病、局部缺血-再灌注损伤和精神障碍，并且更具体地，如阿耳茨海默氏病、亨延顿氏舞蹈病、帕金森氏病和肌萎缩性侧索硬化的神经退化性疾病，如中风(特别是缺血性发作)的局部缺血-再灌注损伤，以及如抑郁、精神分裂症和外伤后压力症的精神障碍。这里的组合物特别适用于预防或治疗由与如中风的局部缺血或再灌注有关的神经损伤引起的疾病。 [0042] 此处组合物的前述作用主要由于其神经保护活性。神经保护活性可以通过多种机理完成，如抑制神经细胞死亡，其包括神经细胞的坏死和凋亡。可以通过抑制半胱天冬酶的活性实现抑制神经细胞凋亡(Guy等人，Cell91：443-446(1987))，这是在这里丝素肽的目标之一。
[0043] 丝素肽在这里还具有优良的改善脑功能或认知功能的活性。如在实施例中所述的，丝素肽在这里显著增加了支持脑功能改善的各种指数，如记忆商数(“MQ”)、学习斜率(learning slope)、记忆保持力、回忆效率、画图/记忆力一致、语言/场景一致、智力/记忆力一致、短期记忆力和专心程度。
[0044] 丝素肽在这里还具有改善或预防由脑疾病引起的损伤的脑功能的优良活性，特别是通过抑制乙酰胆碱的减少。而且，丝素肽在这里通过抑制神经细胞凋亡而预防脑功能的损伤。在优选实施方式中，脑功能为学习能力和/或保持能力。
[0045] 乙酰胆碱为从基底神经节向大脑皮层或海马发出的神经递质，从而发挥对于正常脑功能非常重要的活性(Richter等人，LifeSci.19；26(20)：1683-9(1980))。特别地，已知可以通过作用于乙酰胆碱信号的药物改变学习和记忆。对死于阿耳茨海默型痴呆的人的研究已经表明，主要的乙酰胆碱能神经细胞已被严重损伤。胆碱激动剂和胆碱酯酶抑制剂已被用于患者，并且最近已知乙酰胆碱的增加通过改善认知功能和抑制痴呆发展而对治疗或预防痴呆起作用。直到现在，已经开发出如卵磷酯的乙酰胆碱前体；如RS-86、尼古丁的受体激动剂；以及如他克林和爱丽赛(Aricept)的乙酰胆碱酯酶抑制剂，其前者已被KFDA批准并进入韩国市场，而其后者也在最近被KFDA批准。然而，由于它们的作用不能持续长时间、较弱并且还具有严重的毒性，所以它们的使用仍易于遭受争论。相反，丝素肽在这里对人体表现出可忽略的毒性，所以，对于改善脑功能的药品或食品非常有用。 [0046] 如在这里所用的，术语“预防”指抑制障碍或疾病在包括人的动物中发生，该动物没有被诊断患有但易患有这种障碍或疾病。如在这里所用的，术语“治疗”指(a)抑制障碍或疾病的发展；或者(b)改善或(c)消除障碍或疾病。
[0047] 这里可以使用任何药学上可接受的载体，且其代表性例子包括但不限于碳水化合物(如乳糖、淀粉酶、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉和纤维素)、阿拉伯胶(acacia rubber)、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷、纤维素、水、糖浆、盐溶液、醇、阿拉伯胶(Arabian rubber)、植物油(如玉米油、棉籽油、大豆油、橄榄油和椰子油)、聚乙二醇、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。药物组合物在这里可以进一步包 括但不限于润滑剂、润湿剂、甜味剂、香料、乳化剂、助悬剂和稳定剂。
[0048] 药物组合物在这里可以口服或胃肠外给药，且胃肠外给药的例子包括静脉、皮下和肌内注射。
[0049] 药物组合物的适当剂量水平在这里可以通过考虑如制剂方法、给药类型、年龄、体重、性别、身体健康状况、食物、给药时间和途径、排泄和反应灵敏度的各种信息确定。具有一般技术的医生可以容易地确定和诊断对治疗或预防目标障碍或疾病有效的药物剂量水平。在优选实施方式中，成人的剂量水平为一天一次用药，且每次剂量为0.05～10g。 [0050] 根据常规方法，可以通过使用药学上可接受的载体或填充剂以单位剂量形式或多剂量容器制备药物组合物。制剂类型的代表性例子包括油或水溶液剂、混悬剂、乳剂、浸膏、散剂、颗粒剂、片剂和胶囊剂，并且制剂可以进一步包括分散剂或稳定剂。 [0051] 同时，食品组合物在这里可以包括常规的添加剂，如蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素和香料。例如，作为本发明实施方式的液体药物可以进一步包括柠檬酸、液体果糖、糖、葡萄糖、乙酸、苹果酸、果子露、杜仲皮浸膏、枣浸膏和甘草浸膏。考虑到食品的易食用性，食品组合物在这里非常适用于预防或治疗脑疾病或氧化应激紊乱(oxidative-stress-induced disorder)和改善脑功能。
[0052] 除了前述多种活性之外，与通过化学合成制备的药物相比，由于所述组合物在这里包括天然丝素肽作为活性成分，所以对人体表现出非常低的副作用。
[0053] 通过以下实施例更具体地描述本发明。实施例在这里只是用于说明本发明，而决不是要限制所要求保护的本发明的范围。
附图说明
[0054] 图1为说明MTT还原试验结果的图，以验证一种丝素肽在此对神经细胞凋亡的作用。
[0055] 图2为说明MTT还原试验结果的图，以验证另一种丝素肽在此对神经细胞凋亡的作用。
[0056] 图3是说明Hoechst染色试验的结果并说明一种丝素肽在此抑制神经细胞凋亡。 [0057] 图4是说明Hoechst染色试验的结果并说明另一种丝素肽在此抑制神经细胞凋亡。
[0058] 图5为说明一种丝素肽在此抑制半胱天冬酶的活性的图。
[0059] 图6为说明另一种丝素肽在此抑制半胱天冬酶的活性的图。
[0060] 图7为说明一种丝素肽在此抑制细胞中活性氧的产生的照片。
[0061] 图8为说明另一种丝素肽在此抑制细胞中活性氧的产生的照片。
[0062] 图9为说明丝素肽在此对局部缺血性脑梗塞部分的作用的照片。
[0063] 图10为说明丝素肽在此对局部缺血性脑梗塞部分的作用的图。
[0064] 图11为说明丝素肽在此对局部缺血性脑梗塞部分的作用的图。
[0065] 图12为说明丝素肽在此对局部缺血性脑梗塞部分的作用的照片。
[0066] 图13为说明丝素肽在此预防由局部缺血-再灌注引起的脑损伤的消极躲避试验的结果。
[0067] 图14为说明丝素肽在此预防由局部缺血-再灌注引起的脑损伤的8-臂放射迷宫试验的结果。
[0068] 图15为说明丝素肽在此预防由局部缺血-再灌注引起的脑损伤的海马H&E染色的结果。
[0069] 图16为通过使用患有帕金森氏病的动物模型由阿朴吗啡引起单侧旋转反应的结果。
[0070] 图17为说明丝素肽在此对多巴胺神经细胞具有神经保护作用的图。 [0071] 图18为说明丝素肽在此由于其抗氧化功能对帕金森氏病具有治疗效能的丙二醛试验结果。
[0072] 图19为说明丝素肽对帕金森氏病具有治疗效能的酪氨酸羟化酶染色试验的结果。
[0073] 图20为说明丝素肽对帕金森氏病具有治疗效能的酪氨酸羟化酶染色试验的结果。
[0074] 图21为说明丝素肽在此抑制脑乙酰胆碱浓度降低的图。
[0075] 图22为说明当一次给药时，丝素肽具有抗抑郁活性的图。
[0076] 图23为说明当长时间重复给药时，丝素肽具有抗抑郁活性的图。
[0077] 图24和25为说明BF-7，一种包括丝素肽的胶囊在此具有增加记忆商数(MQ)作用的图。
[0078] 图26为说明BF-7，一种包括丝素肽的胶囊在此具有提高回忆效率作用的图。 [0079] 图27为说明BF-7，一种包括丝素肽的胶囊在此具有提高画图/记忆一致性作用的图。
[0080] 图28为说明BF-7，一种包括丝素肽的胶囊在此具有提高智力/记忆力一致性作用的图。
[0081] 图29为说明BF-7，一种包括丝素肽的胶囊在此具有提高智力/记忆力一致性作用的图。
具体实施方式
[0082] 实施例
[0083] 实施例I：功能性丝素肽，BG201和BG101的制备
[0084] 实施例I-1：制备纯丝纤蛋白
[0085] 这里使用的丝蛋白是通过给家蚕喂全龄桑树叶制备的。从茧除去蛹以除去丝胶蛋白。将150g茧加入到8L水、0.45g碳酸钠和0.75g橄榄油皂的混合物中，并将该混合物煮沸40分钟，以及将该步骤重复两次。通过使用合适量的水煮沸混合物20分钟，重复两次以上和洗三次并干燥，从而使丝胶蛋白被溶掉。减少的质量为37g(减少25％)，并通过洗和干燥该混合物制得纯丝纤蛋白。
[0086] 实施例1-2：丝素肽BG101的制备
[0087] 将35g实施例I-1制备的丝纤蛋白加入到以1:8:2的摩尔比包含氯化钙(CaCl2，1级，Mw＝110.99)、H2O和乙醇的溶液中，并在90℃下 溶解5小时。通过使用纱网和无纺布过滤该混合物以除去杂质，并通过加入相同量的蒸馏水进行稀释。通过使用具有10cm直径和1m长度的凝胶色谱仪(GradiFac系统，Pharmacia Biotech，Sephadex G-25Media，HiLoad P-50泵UV-1监测器，瑞典)除去中性盐。向制得的丝纤蛋白溶液中加入1％以下蛋白酶的组合之一，并在55℃下进行5小时水解：(1)1:1的风味蛋白酶和糖化酶(NOVA，美国)，(2)1:1的胰蛋白酶和胃蛋白酶，(3)1:1的高温蛋白酶和碱性蛋白酶。将该混合物在
100℃下热处理5～10分钟以消除酶的活性，并冷却干燥，从而得到命名为“BG101”的粉末。
100℃下热处理5～10分钟以消除酶的活性，并冷却干燥，从而得到命名为“BG101”的粉末。
[0088] 实施例I-3：丝素肽BG201的制备
[0089] 将113g实施例I-1制备的丝纤蛋白加入到3,400mL氯酸溶液(25％)中，并在110℃下进行12小时水解，随后通过加入氢氧化钠溶液(4M)以保持pH值为5.0～5.5。
将该溶液纸过滤并通过填充有活性碳的过滤器，然后是通过使用自动控制电流和电压分别为20mA和15V的电渗析仪的电解脱盐过程。通过使用喷雾干燥器制得了粉末并命名为“BG201”。
将该溶液纸过滤并通过填充有活性碳的过滤器，然后是通过使用自动控制电流和电压分别为20mA和15V的电渗析仪的电解脱盐过程。通过使用喷雾干燥器制得了粉末并命名为“BG201”。
[0090] 实施例II：丝素肽的分析
[0091] 实施例II-1：分子量
[0092] 通过使用凝胶过滤色谱法确定BG101和BG201的绝对分子量。具体地，通过使用0.2N NaNO3溶液作为缓冲溶液将样品的浓度控制在0.5％之内，并获得样品的特性数据，如折射率(RI)、光散射(LS)、衍射压力(diffraction pressure)、UV吸收(280nm)。使用从数据自动计算绝对分子量分布的GPC系统(Viscotec，美国)。使用聚环氧乙烷(PEO，Mw＝
110,000)作为标准品用于验证重现性，且BG101和BG201的重均分子量被分别验证为1070和850。
110,000)作为标准品用于验证重现性，且BG101和BG201的重均分子量被分别验证为1070和850。
[0093] 实施例II-2：在不同溶剂中的溶解度
[0094] 将0.1g丝素肽粉末溶于10mL蒸馏水、乙醇、甲醇、丙酮和二甲基甲酰胺中，并测定BG101和BG201在这些溶剂中的溶解度(％)，如表1中所示。BG101和BG201被证明在蒸馏水中完全可溶，而在如乙醇和甲醇的有机溶剂中的溶解度急剧下降。
[0095] 表1
[0096]溶剂 蒸馏水 乙醇 甲醇 丙酮 二甲基甲酰胺
BG101 100 20 45 30 50
BG201 100 30 50 32 50
BG101 100 20 45 30 50
BG201 100 30 50 32 50
[0097] 实施例II-3：在不同pH值下的溶解度
[0098] 将0.1g丝素肽粉末溶于10mL蒸馏水中。测定在pH值为3、5、7、9和11下的溶解度，并通过使用0.1N盐酸和氢氧化钠调节pH值。如表2中所示，不管溶剂的pH值，丝素肽被证明完全可溶。
[0099] 表2
[0100]pH值 3 5 7 9 11
BG101 100 100100 100100
BG201 100 100100 100100
BG101 100 100100 100100
BG201 100 100100 100100
[0101] 实施例II-4：氨基酸的量
[0102] 进行成分分析以分别确定BG101和BG201中氨基酸的量。将0.05％的各样品加入1mL氯酸溶液中并进行氮化处理，随后在110℃下水解18小时。使该溶液完全蒸发掉盐酸，并用pH值为2.2的负荷缓冲 溶液(loading buffer solution)稀释。通过使用自动氨基酸仪(Biochrom20Plus，瑞典)对氨基酸进行成分分析，且表3中给出结果。
[0103] 表3
[0104]氨基酸 BG201 BG101
Gly 43.2 42.46
Ala 27.2 26.64
Ser 15.94 11.24
Tyr 2 4.41
Val – 2.02
Asp 1.45 2.11
Glu 1.61 1.68
Thr 0.6 –
Met 0.15 0.11
Ile 0.98 0.65
Leu 0.71 0.57
Phe 1 0.76
His 0.52 0.52
Lys 0.38 1.04
Arg 1.01 1.04
总计 96.21 95.25
Gly 43.2 42.46
Ala 27.2 26.64
Ser 15.94 11.24
Tyr 2 4.41
Val – 2.02
Asp 1.45 2.11
Glu 1.61 1.68
Thr 0.6 –
Met 0.15 0.11
Ile 0.98 0.65
Leu 0.71 0.57
Phe 1 0.76
His 0.52 0.52
Lys 0.38 1.04
Arg 1.01 1.04
总计 96.21 95.25
[0105] 如上表3中所示，BG101和BG201在氨基酸含量方面彼此相似，而它们在其体内或体外活性方面表现出明显的差别，这意味着制得的丝素肽根据其制备方法具有不同的结构。
[0106] 试验实施例I：神经保护活性和抗氧化功能的验证
[0107] 进行以下提出的试验，以验证丝素肽对神经细胞的作用。
[0108] 试验实施例I-1：神经细胞的选择和细胞的培养
[0109] 根据Okuda′s方法(Okuda S等人，Neuroscience63(3)：691-9(1994))，通过进行神经细胞的原始培养制备纯神经细胞。具体地，从15天小鼠胚胎(E15)制备纹状体，并通过0.25％胰蛋白酶和0.01％DNaseI的处理分离各细胞，并用移液管进一步分离。将各5 2
细胞以1×10 细胞/cm 的密度置于PEI涂层板上，并通过使用阿糖胞苷抑制神经胶质细胞的培养。而且，将神经元衍生细胞系SK-N-SH或SHS-Y5Y(ATCC，美国)以80％的密度置于PEI涂层板上，并通过使用包含DMEM或RPMI和10％FBS的培养溶液培养。如以下试验实施例中所阐述的，在淀粉样蛋白β(Aβ)、6-羟基多巴胺(6-OHDA)、神经酰胺、H2O2或3-羟基犬尿氨酸(3-HK)处理之前，通过使用低血清培养基(含有1％FBS)进行预处理。 [0110] 试验实施例I-2：MTT还原试验(细胞存活的验证)
细胞以1×10 细胞/cm 的密度置于PEI涂层板上，并通过使用阿糖胞苷抑制神经胶质细胞的培养。而且，将神经元衍生细胞系SK-N-SH或SHS-Y5Y(ATCC，美国)以80％的密度置于PEI涂层板上，并通过使用包含DMEM或RPMI和10％FBS的培养溶液培养。如以下试验实施例中所阐述的，在淀粉样蛋白β(Aβ)、6-羟基多巴胺(6-OHDA)、神经酰胺、H2O2或3-羟基犬尿氨酸(3-HK)处理之前，通过使用低血清培养基(含有1％FBS)进行预处理。 [0110] 试验实施例I-2：MTT还原试验(细胞存活的验证)
[0111] 为了验证BG101和BG201对神经细胞凋亡的作用，通过以下修正的已知方法 (Shearman 等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.91(4)：1470-4(1994)；Shearman 等 人，J.Neurochem.65(1)：218-27(1995)；和Kaneko等人，J.Neurochem.65(6)：2585-93(1995))进行MTT还原试验。用10pM BG101或BG201处理上述试验实施例中选择并培养的神经细胞6小时，随后加入10μM Aβ、10μM6-OHDA、10μM神经酰胺、300μM H2O2或250μM3-HK。加入的物质由于细胞的细胞毒性在36小时内引起约50％的细胞凋亡。
[0112] 将该样品在37℃下、于5％CO2中培养48小时，随后在加入3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT：Sigma，美国)溶液至0.5mg/mL的浓度之后，进一步培养4.5小时。
[0113] 将由MTT还原形成的甲簪(formazan)沉淀溶于0.1N HCl的无水异丙醇溶液，并通过使用ELISA读出器(分子仪，美国)测量在570nm处的吸收。如图1和2中所示，通过选择100％的细胞存活率(对照组，只是使用的溶剂)和0％的细胞存活率(细胞被0.9％Triton X-100全部破坏)之间的适当值确定各样品的值。图1和2中的值表示为“平均值±标准偏差”。BG101和BG201经验证对抑制神经细胞凋亡有效(P<0.05)。
[0114] 同时，为了核对前述结果，通过用台盼蓝或结晶紫染色以用血细胞计数器测量总细胞和凋亡细胞的各数目，从而以“存活细胞/总细胞”进一步测定细胞存活率。得到的结果证明与前述结果非常相似。另外，验证了细胞死亡以细胞凋亡的形式发生，其通过在Hoechst染色之后的DNA降解的观察也被验证。
[0115] 试验实施例I-3：Hoechst染色
[0116] 如在试验实施例1-2中所阐明的，用BG101或BG201处理神经细胞6小时并培养，随后加入10μM Aβ、10μM6-OHDA、10μM神经酰胺、300μM H2O2或250μM3-HK。用4％多聚甲醛(在PBS中，pH7.4)固定细胞15分钟，并用BPS洗，随后用8μg/ml的Hoechst染料33258溶液(Sigma，美国)染色5分钟。它们被用蒸馏水洗两次并用甘油:PBS混合物(9：
1)制成样品，并在荧光显微镜(奥林巴斯显微镜，日本)下分析，如图3和4中所示。只用细胞凋亡诱导剂处理的细胞表现出典型的细胞凋亡形态，如染色质凝聚和核碎裂，其被BG101和BG201的预处理和随后的损伤处理有效抑制。参照对照组的模拟试验表现出正常的核形态。如图2中所示，BG101和BG201在这里经证明对抑制细胞凋亡有效，这证实了前述试验实施例I-2的可靠性。
1)制成样品，并在荧光显微镜(奥林巴斯显微镜，日本)下分析，如图3和4中所示。只用细胞凋亡诱导剂处理的细胞表现出典型的细胞凋亡形态，如染色质凝聚和核碎裂，其被BG101和BG201的预处理和随后的损伤处理有效抑制。参照对照组的模拟试验表现出正常的核形态。如图2中所示，BG101和BG201在这里经证明对抑制细胞凋亡有效，这证实了前述试验实施例I-2的可靠性。
[0117] 试验实施例1-4：半胱天冬酶活性试验
[0118] 进行以下试验以验证对细胞凋亡的抑制是由于对半胱天冬酶活性的抑制。如在试验实施例I-2中所阐明的，用BG101或BG201处理神经细胞6小时并培养，随后加入10μM Aβ、10μM6-OHDA、10μM神经酰胺、300μM H2O2或250μM3-HK。通过用细胞溶解缓冲溶液6
(50mMTris-Hcl，0.03％IGEPAL，1mM DTT，pH7.5)破坏每P100板10×10 个细胞得到溶解细胞的溶液。将500μM的Ac-DEVD-AMC(酶系统产品，加拿大)，其为由HEPES缓冲溶液(40mM HEPES，pH7.5，20％甘油，4mM DTT)制备的半胱天冬酶的荧光产生底物加入到50μL溶解细胞的溶液中，并在37℃下进行1小时反应。通过预处理10μM的泛半胱天冬酶抑制剂z VAD-FMK(酶系统产品，ESP，加拿大)制备阳性对照。通过使用荧光分析仪(Perkin-Elmer光度计；激发波长380nm，发射波长420～460nm)测量当底物被半胱天冬酶分裂时发出的荧光度。为了定量测得的荧光，通过使用分裂的FMK的荧光度制备标准曲线(图5和6；
P<0.05)。如图5和6中所示，BG101或BG201在这里被证明抑制由细胞凋亡诱导剂引起的半胱天冬酶活性。所以，可以得出BG101和BG201的细胞凋亡抑制作用与抑制半胱天冬酶活性有关的结论。
(50mMTris-Hcl，0.03％IGEPAL，1mM DTT，pH7.5)破坏每P100板10×10 个细胞得到溶解细胞的溶液。将500μM的Ac-DEVD-AMC(酶系统产品，加拿大)，其为由HEPES缓冲溶液(40mM HEPES，pH7.5，20％甘油，4mM DTT)制备的半胱天冬酶的荧光产生底物加入到50μL溶解细胞的溶液中，并在37℃下进行1小时反应。通过预处理10μM的泛半胱天冬酶抑制剂z VAD-FMK(酶系统产品，ESP，加拿大)制备阳性对照。通过使用荧光分析仪(Perkin-Elmer光度计；激发波长380nm，发射波长420～460nm)测量当底物被半胱天冬酶分裂时发出的荧光度。为了定量测得的荧光，通过使用分裂的FMK的荧光度制备标准曲线(图5和6；
P<0.05)。如图5和6中所示，BG101或BG201在这里被证明抑制由细胞凋亡诱导剂引起的半胱天冬酶活性。所以，可以得出BG101和BG201的细胞凋亡抑制作用与抑制半胱天冬酶活性有关的结论。
[0119] 试验实施例1-5：细胞内活性氧的定量测定
[0120] 活性氧为老化的主要原因，并且还直接或间接引起许多种疾病。因此，本发明研究了丝素肽在这里对活性氧的作用。
[0121] 如在试验实施例I-2中所阐明的，用BG101或BG201处理细胞6小时并培养，随后加入10μM Aβ、10μM6-OHDA、10μM神经酰胺、300μM H2O2或者250μM FeSO4或3-HK。用10μM溶于HCSS缓冲溶 液(20mM HEPES、2.3mM CaCl2、120mM NaCl、10mM NaOH、5mMKCl、
1.6mM MgCl2、15mM葡萄糖)的DCFDA(6-羧基-2′，7-二氯-二氢荧光素二乙酸酯，二羧基-乙基酯)和2％的助悬剂-聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物(pluronic F-127)在37℃下处理培养的细胞30分钟。通过使用装有汞灯荧光附件(激发波长488nm，发射波长510nm)的奥林巴斯IX70在室温下观察由细胞中活性氧产生的DCF荧光，并通过CCD照相机捕捉和通过使用NIH图象1.65程序分析屏幕(图7和8)。
1.6mM MgCl2、15mM葡萄糖)的DCFDA(6-羧基-2′，7-二氯-二氢荧光素二乙酸酯，二羧基-乙基酯)和2％的助悬剂-聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物(pluronic F-127)在37℃下处理培养的细胞30分钟。通过使用装有汞灯荧光附件(激发波长488nm，发射波长510nm)的奥林巴斯IX70在室温下观察由细胞中活性氧产生的DCF荧光，并通过CCD照相机捕捉和通过使用NIH图象1.65程序分析屏幕(图7和8)。
[0122] 图7和8中的模拟试验指只用溶剂处理的样品。活性氧被证明是由Aβ、6-OHDA、神经酰胺、H2O2、FeSO4或3-HK处理产生的(图4)，而BG101或BG201的预处理显著抑制了由细胞凋亡诱导剂产生的活性氧。
[0123] 所以，可以得出BG101或ED具有通过抑制由淀粉样蛋白β、6-OHDA、神经酰胺、H2O2、FeSO4或3-HK诱导产生活性氧的抗氧化活性的结论。
[0124] 试验实施例II：局部缺血动物模型试验
[0125] 进行以下试验以研究丝素肽BG101或BG201在这里对局部缺血脑梗塞区域的作用。
[0126] 试验实施例II-1：局部缺血诱导动物模型
[0127] A.局部缺血诱导动物模型的药物处理和制备
[0128] 通过使用雄性Sprague-Dawle大鼠(200～250g)制备局部缺血诱导动物模型。赋形剂给药组(vehicle treated group)(n＝6)在局部缺血诱导前或后1小时口服给予1g/Kg的BG101，而赋形剂对照组(vehicle conrol group)(n＝6)给予相同量的盐溶液。通过肌内注射以30～40mg/Kg给予试验受试动物氯胺酮(ketamine)并使其麻醉。分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。电灼为颈外动脉分支的上甲状旁腺和后窝，以及为颈内动脉分支的翼腭，并切除颈外动脉。通过将4-0尼龙线(ETHICON公司，美国)通过颈外动脉并入颈内动脉中进行大脑中动脉端点的阻塞，并将10～18mm尼龙线放置于颈总动脉内。 [0129] B.局部缺血脑梗塞面积的减少
[0130] 诱导局部缺血后6小时从动物切开脑。以2mm间隔从前极切下被切开的脑，并在37℃下与2％三苯基四唑氯化物(TTC，Sigma，美国)反应30分钟，随后使用4％多聚甲醛(Sigma，美国)固定。对组织部分进行照相(图9和12)，且通过使用MCID图像处理系统(图像研究公司，加拿大)测量染成红色的正常区域和白色梗塞区域的面积，从而计算面积的平均比(图10)。
[0131] 如图9中所示，丝素肽在这里将梗塞区域的面积减小到可以被公认的统计显著性水平(P<0.05)。发现减小梗塞的作用遍及脑(图10)。另外，也验证了梗塞区域与整个大脑的体积比被BG101的预处理减小，如图10和11中所示(平均值±标准偏差)。 [0132] 而且，如图12中所说明的，当局部缺血性脑梗塞被诱导后用此处的丝素肽处理时，已证明减小了局部缺血性脑梗塞区域。
[0133] 所以，经验证丝素肽具有预防和治疗缺血性发作的活性，并且可用于该目的的功能性食品或药物。
[0134] 试验实施例II-2：局部缺血再灌注诱导动物模型
[0135] A.局部缺血再灌注诱导动物模型的药物处理和制备
[0136] 通过肌内注射以30～40mg/Kg给予雄性Sprague-Dawley大鼠(200～250g)氯胺酮，并使其麻醉。分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。电灼为颈外动脉分支的上甲状旁腺和后窝，以及为颈内动脉分支的翼腭，并切除颈外动脉。将4-0尼龙线通过颈外动脉并入颈内动脉中，并将10～18mm尼龙线放置于颈总动脉内。从麻醉恢复后1小时，通过缝合切开的皮肤和除去尼龙线进行再灌注。
[0137] 从局部缺血-再灌注的次日开始，7天、每天一次给予1g/kg的BG101或BG201。以与标准对照组和药物治疗组相同的量和频率给予生理盐水溶液的局部缺血对照组被用作赋形剂对照组。诱导局部缺血-再灌注后7天，进行消极躲避试验和8臂迷宫试验。 [0138] B.学习和记忆力分析
[0139] B-1.消极躲避试验
[0140] 使用自动穿梭箱(型号PACS-30，哥伦布器械国际公司)作为试验设备。穿梭箱被中间门(3″L x2.625″W)分隔成两个具有相同面积(19″Lx9″W x10.875″H)的室，并且其地板安装有产生电流的装置。各室可以在铰接树脂玻璃盖上点一20W电灯泡。白鼠可以通过门进入暗室。噪音控制在60dB以下，并在暗室中进行该试验。最初将Dawley鼠放入亮室中，当门打开时将其转移到暗室。此时，门自动关闭且灯被关上。重复该试验直到该鼠在20秒内转移到暗室。达到该规律后26小时，当该鼠进入暗室时，将门关闭，并在暗室的地板上产生1mA电流3秒。诱导局部缺血-再灌注后7天，将该鼠放入亮室中，并测量该鼠转移到暗室中所需的时间。将时间限制到5分钟(图13)。
[0141] 如图13中所示，等待时间与记忆损伤和恢复有关，并且等待时间的延长意味着记忆的改善。等待时间不随假手术对照组变化，而其被只给予溶剂的局部缺血对照组显著降低(p<0.05)。同时，在BG101或BG201治疗组的情况下，证明等待时间明显恢复到正常状态(P<0.05)。特别是，发现BG101更有效，因为其比BG201引起更有效的等待时间的恢复。 [0142] B-28臂放射迷宫试验
[0143] 使用8臂放射迷宫(Etho Vision，荷兰)作为试验设备。其为从底部向上45cm，其中，八臂(60cm长和12cm宽)伸出八角形中心(半径：34cm)，并且臂和中心部分包括壁(45cm高)。将喂养杯置于每个臂的末端。使用葵花籽作用奖赏。通过使用50W电灯泡在迷宫周围保持黑暗，并且用摄像机监控迷宫。减少食物到80％1周后进行学习试验。3天、每天3次将雄性大鼠放入迷宫中用于训练，并测量到臂的频率和时间直到大鼠吃掉所有的种子。继续该训练直到差错数在2分钟内达到2次以下。再次进入已去过的臂被认为是差错。 [0144] 通过使用训练的雌性大鼠如下制备局部缺血动物模型。7天、每天1次给予大鼠1g/kg的BG101或BG201，并且与对照组比较差错数和等待时间。
[0145] 通过使用由堵塞大脑中动脉(MCA)制备的局部缺血动物模型进行8臂迷宫试验，以验证BG101或BG201对消极躲避试验不能证实的空间记忆的活性。从给药后一周进行5天试验，并且对照组在手术前和后之间没有显示任何改善(图14)。在BG101或BG201处理组的情况下，从第三天差错数明显减少，并且特别是BG101处理组表现出更大的下降。直到最后一天，BG101或BG201处理组也维持较低的差错数，而只用溶剂处理的对照组没有表现*出任何恢复(，P<0.05)。
[0146] 前述结果说明大脑中动脉的暂时阻塞损害了空间记忆，而重复给予BG101或BG201恢复了由局部缺血引起的学习和记忆能力的损伤。图14中的测量值指平均值±标准偏差(SD)。
[0147] C.苏木精和曙红(H&E)在海马中的染色
[0148] 已报道由脑缺血引起的记忆和学习能力的退化与海马的损伤有关(Hodges等人，Neuroscience，72(4)，959-88，1996)。所以，在海马的一定区域(CA1，CA2，DG)中测定本发明的活性。
[0149] C-1.组织的制备
[0150] 将经历试验实施例II-2B的试验动物用400mg/mL的水合氯醛麻醉，并通过心脏灌注200mL的0.1M磷酸缓冲溶液(PBS，pH7.4)，从而除去血管中的血液成分，随后再灌注250～300mL的固定溶液(4％多聚甲醛/PBS)。将脑切开并用固定溶液在4℃向后固定15～
24小时。用PBS洗固定溶液后，以10％、20％和30％的顺序加入蔗糖溶液，从而防止冰晶。
用包埋溶液包埋脑组织，并用液氮在异戊烷预冻中快速冷冻。通过使用切片机(低温恒温器；Reichert Frigocut型2000)将脑组织连续冠状切成10μm厚，立即附着于涂覆有明胶的载玻片上，在室温下干燥1小时，并置于-70℃下。
24小时。用PBS洗固定溶液后，以10％、20％和30％的顺序加入蔗糖溶液，从而防止冰晶。
用包埋溶液包埋脑组织，并用液氮在异戊烷预冻中快速冷冻。通过使用切片机(低温恒温器；Reichert Frigocut型2000)将脑组织连续冠状切成10μm厚，立即附着于涂覆有明胶的载玻片上，在室温下干燥1小时，并置于-70℃下。
[0151] C-2H&E染色
[0152] 用蒸馏水洗载玻片，并用苏木精孵育10分钟。反应后，用包含1％HCl的70％乙醇处理该载玻片，从而除去剩余的苏木精，并通过浸 润氨(treating ammonia)固定。用曙红染色该组织20秒，并用蒸馏水洗。其分别用70％、90％和100％乙醇干燥，并用二甲苯处理以及用盖玻片和枞香脂密封，随后用光学显微镜观察。
[0153] C-3.H&E染色的分析结果
[0154] 作为用BG101在海马中H&E染色的结果，在只用局部缺血诱导的对照组的情况下，嗜曙红细胞现象被发现遍及海马(CA1，CA2，DG)，其为典型的细胞凋亡(图5，箭头)。同时，BG101处理组表现出正常细胞的显著增加。
[0155] 尽管仍然要进一步研究确切的机理，但是BG101或BG201经验证具有预防神经细胞凋亡和脑损伤的活性，并且可用于治疗局部缺血的新药。
[0156] 试验实施例III：使用帕金森氏病动物模型的试验
[0157] 广泛用于诱导帕金森氏病的6-羟基多巴胺(6-OHDA)通过儿茶酚胺能神经细胞膜被吸收，并对儿茶酚胺能神经细胞表现出选择性毒性效应。通过在一侧脑中加入6-OHDA损害多巴胺神经细胞的动物模型由于可以使用另一侧脑作为对照组，所以被广泛使用，从而能够在自发运动和药物诱导的旋转运动之间进行比较。
[0158] 进行以下实施例以验证BG101和BG201对帕金森氏病的作用。
[0159] 试验实施例III-1：进行性帕金森氏病动物模型的制备
[0160] 根据Joo的方法(Joo WS等人，Neuroreport，9(18)，4123-4126，1998)，如下通过在鼠的一侧纹状体中加入6-OHDA，并在多巴胺神经细胞中诱导逐步再生而制备动物模型。
[0161] 通过腹膜内注射以3mL/kg给予8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠(约200～250g；从Dae Han BioLink公司，韩国购买)equithesin。通过使用立体定位架(David Kopf，美国)将麻醉动物的头骨穿孔，并通过使用汉密尔顿注射器(10μL，26G针)以1μL/min给假手术组在其右纹状体注射0.2mg/mL抗坏血酸，而以相同的方式给损毁组以及BG101或BG201处理组注射多巴胺氢氧化物(在0.2mg/mL抗坏血酸中的20μg/5μL游离碱)(Paxinos等人，J.Neurosci.Methods.3(2)，129-149，1980)。药物注射后5分钟，以1mm/min撤出针，并缝合切开部分。同时，以1g/kg和5g/kg的两个剂量口服给予BG101或BG201。 [0162] 在进行性帕金森氏病动物模型中，通过在制备损伤后14天使用阿朴吗啡分析行为变化首次证实了多巴胺氢氧化物的作用，并且在本试验中使用在次日从连接处取出脑脊髓后被提取的脑。为了验证BG101或BG201对多巴胺神经细胞的保护作用，进行通过使用HPLC的脂类过氧化水平、纹状体中的多巴胺浓度以及对酪氨酸羟化酶的免疫组织化学染色。
[0163] 试验实施例III-2：由阿朴吗啡诱导的单侧旋转反应
[0164] 为了验证通过使用多巴胺氢氧化物制备的帕金森氏病动物模型随时间的行为变化，在诱导损伤后14天，在后颈皮下注射15mg/kg的阿朴吗啡，并测量单侧旋转反应60分钟(图16)。该试验使用以下原理，当由于多巴胺能神经细胞的死亡引起纹状体中多巴胺浓度下降时，多巴胺受体的超敏感性被诱导，并且阿朴吗啡作为激动剂作用于多巴胺受体，从而过度地激动超敏感性诱导的纹状体。其结果，动物在与受损区域相反的方向表现出旋转反应(Ungerstedt，Brain Res.24，485-493，1970)。参照前述Ungerstedt的杂志，通过使用自动旋转流量计测量旋 转反应，并通过使用以下公式计算净旋转：净旋转＝对侧旋转-同侧旋转。
[0165] 如图16中所示，在纹状体中给予0.2mg/mL抗坏血酸的标准对照组没有表现出单侧净旋转的大量改变，而只给予多巴胺氢氧化物的损毁诱导对照组表现出明显的增加(P<0.05)。同时，与对照组相比，给予此处的丝素肽的目标组表现出明显减少，并且经证明当剂量增加时作用增大(P<0.05)。图16中的各值指平均值±标准偏差。
[0166] 试验实施例III-3：纹状体中多巴胺及其代谢物的量的测量
[0167] 如试验实施例III-2中所阐明的，为了验证BG101或BG201对帕金森氏病的重要原因——多巴胺浓度的作用，在给予BG101或BG201并遭遇损毁后2周，通过使用HPLC(Gilson，法国)测量了纹状体中多巴胺(DA)和3，4-二羟基苯基乙酸(DOPAC)的浓度。
[0168] A.组织的制备
[0169] 从连接处取出其脑脊髓后，提取大鼠的脑，并通过使用脑切片机(ZIVIC MILLER，美国)从视交叉以2mm的间隔剪切，并用组织打孔机(tissue punch)分离黑质。在冷冻玻璃板上将剩余脑的前部分成左和右大脑半球。只分离和提取纹状体，并用干冰快速冷冻，并保持在-70℃。
[0170] B.分析方法
[0171] 用0.1M高氯酸和1mM的EDTA处理冷冻的试验品后，用超声波仪分离组织匀浆，并通过以12,500g离心分离20分钟得到上部溶液。将上部溶液过滤到硝酸纤维膜过滤纸TM(过滤尺寸0.2μm)上，并加入到HPLC中。使用WATERS uBondapak C183.9x300mm柱(粒度 10μm)，并且以0.7mL/min的速率使用0.07M磷酸二氢钠、1mM辛烷磺酸钠、0.1mM EDTA和8％乙腈的混合物(pH4.0)作为流动相。当制备组织匀浆时，已加入预定二羟基苄胺作为内标物质以测量各物质的浓度，并通过使用电化学式分析仪确定分离的物质。 [0172] C.HPLC分析的结果
[0173] 如图17中所给出的，与假手术对照组相比，只用多巴胺氢氧化物处理的对照组中，纹状体中的多巴胺比(同侧/对侧，％)被显著降低(P<0.05)。同时，在丝素肽处理组中，多巴胺的浓度显著增加，并且与给药剂量成比例(P<0.05)。图17中的各值指平均值±标准偏差。
[0174] 当由于黑质中多巴胺神经细胞的破坏导致纹状体中多巴胺下降时，引起帕金森氏病。由6-OHDA诱导的多巴胺浓度的降低是黑质中多巴胺神经细胞和纹状体中多巴胺神经小纤维终端破坏的重要标志。事实上，与健康人相比，在帕金森氏病最后阶段的患者的情况下，纹状体中只剩余约10％的多巴胺。所以，丝素肽在这里在生理学上和生物化学上被证明能够抑制多巴胺浓度的降低，从而具有对多巴胺神经细胞的保护活性。
[0175] 试验实施例III-4：纹状体中脂类过氧化水平的测定(丙二醛试验)
[0176] 为了证明BG101或BG201如何抑制脂类过氧化，如试验实施例III-2中所阐明的，在给予BG101或BG201和制备损毁后2周，在纹状体中测量丙二醛(MDA)的量。 [0177] A.组织的制备
[0178] 根据前述方法提取纹状体，通过加入Krebs-Ringer缓冲液(NaCl120mM，KCl4.8mM，CaCl21.3mM，MgSO41.2mM，NaHCO325mM，葡萄糖6mM，pH7.6)和通过使用超声波仪制备组织匀浆。
[0179] B.脂类过氧化的测定
[0180] 根据Ohkawa的方法(Anal Biochem.95(2)：351-8(1979))，测定作为脂类过氧化指标的TBARS(硫代巴比土酸反应物质)浓度。向预定量的组织匀浆中加入8.1％SDS、20％乙酸(pH2.5)、0.8％硫代巴比土酸(TBA)以及还加入BHT(2，6-二叔丁基-对甲酚，200μM)以抑制自氧化后，在100℃下进行30分钟反应。将反应器置于冰水中以快速终止反应后，测定532nm处的吸收，并计算TEARS浓度。
[0181] 根据Lazzarino等人(Lazzarino等人，Free.Radic.Biol.Med.13(5)，489-98，1992)和Chirico(1987)的方法，通过使用HPLC测定了MDA-TBA(丙二醛-硫代巴比土酸)复合物的浓度。将样品注入5μMLichrosper100RP18柱(4.6x250mm)，通过使用65％KH2PO4(50mM)/15％甲醇/20％乙腈以0.9mL/min的速率洗脱，并通过使用1，1，3，3-四甲氧基丙烷(在乙醇/水40:60中制备的，v/v)作为用于BG101A-TBA复合物峰的标准样品，用UV/可见检测器(Hewlett-Packard，1050系列)检测。
[0182] C.结果
[0183] 纹状体中MDA产生比(同侧/对侧，％)以MDA-TBA复合物与TBARS的浓度比(％)示于图18中。与假手术对照组相比，在只给予多巴胺氢氧化物的对照组的情况下，纹状体中的脂类过氧化水平显著增加(P<0.05)。同时，与对照组相比，丝素肽给药组表现出脂类过氧化水 平的明显下降，并且下降程度与给药剂量成比例(P<0.05)。图18中的各值指平均值±标准偏差。
[0184] 作为老化和变性疾病的最重要的原因，活性氧诱导蛋白质和脂类的过氧化，削弱细胞的正常功能，并且诱导氧化损伤和DNA突变。最近报道，由于帕金森氏病患者体内亚铁离子的增加，如谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的抗氧化酶减少，且羟基离子异常增加，并且该报道指出氧化应激为诱导帕金森氏病的重要因素(Ogawa，Eur.Neurol.34(suppl)，20-28，1994)。所以，可以得出可以降低脂类过氧化程度的丝素肽在这里具有抑制老化过程的活性。
[0185] 试验实施例III-5：黑质中TH免疫阳性细胞比的测定(TH免疫组织化学试验) [0186] 为了验证BG101或BG201在这里对帕金森氏病动物模型的作用，进行了TH免疫组织化学试验。如试验实施例III-2中所阐明的，在给予BG101或BG201和制备损毁后2周，进行黑质切片的TH免疫组织化学染色，并且通过使用大功率显微镜计算染色的TH免疫-阳性细胞的数目。
[0187] A.组织的制备
[0188] 如试验实施例II-2中所阐明的，在给予试验动物BG101或BG201和诱导损毁后，用400mg/mL的水合氯醛麻醉试验动物，并通过心脏再灌注200mL的0.1M磷酸缓冲液缓冲溶液(PBS，pH7.4)，从而除去血管中的血液成分，随后再灌注250～300mL的固定溶液(4％多聚甲醛/PBS)。将脑切开并用固定溶液在4℃下向后固定15～24小时。用PBS洗固定溶液后，以10％、20％和30％的顺序加入蔗糖溶液，从而防止 冰晶。用包埋溶液包埋脑组织，并用液氮在异戊烷预冻中快速冷冻。通过使用显微切片机(低温恒温器；Reichert Frigocut型2000)将脑组织连续冠状切成10μm厚切片，并置于包含30％甘油、30％乙二醇和10％磷酸盐缓冲溶液(PB)的防腐溶液中。
[0189] B.免疫组织化学分析
[0190] 从防腐溶液中取出组织，用PBS洗3次，每次10分钟，并与5％过氧化氢反应10分钟，随后与10％标准山羊血清(NGS)、3％BSA(Sigma)和0.3％Triton X-100反应30分钟。以下面的顺序，其与作为第一抗体的小鼠αTH(稀释比＝1:500，Boehringer Mannheim)反应1天，与作为第二抗体的生物素化Vector实验室(美国)在室温下反应1小时，并与30分钟前以1:100的比预稀释的抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(ABC，Vector实验室，美国)在室温下反应1小时。将该组织置于DAB(二氨基联苯0.05％，H2O20.003％)5分钟以显示，并将其附着于涂覆有明胶的载玻片并干燥。其通过使用70％、90％和100％乙醇脱水，用二甲苯处理，用盖玻片和枞香脂密封，并用显微镜观察。在上述培养步骤中，用PBS洗过量的试剂3次，每次10分钟。通过使用标准血清代替第一和第二抗体进行比较染色。
[0191] C.免疫组织化学分析的结果
[0192] 在图19和20中分别给出了纹状体和黑质中用BG101或BG201进行TH免疫组织化学染色的结果，和黑质中TH免疫阳性细胞比(同侧/对侧，％)的方差。
[0193] 如图19中所示，在标准对照组中，清楚地表示了纹状体中TH免疫染色和黑质中多巴胺神经细胞。相反，在损毁对照组中，在Doso- 侧面区域中纹状体没有染色，并且黑质致密部中的大多数多巴胺神经细胞被破坏。同时，与对照组相比，给予丝素肽的组在这里表现出对多巴胺神经小纤维终端明显的保护活性。
[0194] 如图20中所示，与标准对照组相比，在只给予多巴胺氢氧化物的损毁对照组中，TH免疫阳性细胞明显减少(P<0.05)。同时，给予丝素肽的组在这里经验证显著增加了TH免疫阳性细胞，并且该增加与给药剂量成比例(P<0.05)。图20中的各值指平均值±标准偏差。
[0195] TH为从酪氨酸产生多巴胺中重要的酶。TH染色的多巴胺神经细胞和终端可以产生多巴胺和形成多巴胺能神经网络。因此，前述结果表明，丝素肽在这里具有多巴胺神经细胞的保护活性。所以，丝素肽在这里可以在用于预防或治疗退化性脑疾病——帕金森氏病的功能性食品或药物中使用。
[0196] 试验实施例IV：乙酰胆碱浓度的作用
[0197] 进行试验以验证BG101或BG201在这里抑制用淀粉样蛋白β处理的大鼠脑中乙酰胆碱的减少，从而起到改善脑活性和抑制退化性脑疾病的作用。
[0198] 试验实施例IV-1：动物试验受试者的制备
[0199] 在恒定条件(温度：25±1℃，相对湿度：60±10％)下，各箱中放入4只Sprague Dawley大鼠(140～180g，Dae Han BioLink公司，韩国)，并用没有限制的水和食物喂养1周。
[0200] 试验实施例IV-2：乙酰胆碱浓度的测定
[0201] 根据Islael和Lesbats的方法(J Neurochem.37(6)：1475-83(1981))，通过使用化学发光测定乙酰胆碱的浓度。该方法使用以下反应：乙酰胆碱被酯酶水解成胆碱，并进一步被胆碱氧化酶变成甜菜碱(bastaine)和过氧化氢。当与luinol(5-氨基-1，2，3，4-四氢-1，4-酞嗪二酮；默克，达姆施塔特，德国)和过氧化物酶(Sigma，美国)化学反应时，过氧化氢发出光，并且可以使用发射光的量确定乙酰胆碱的浓度。
[0202] 与标准对照组相比，Aβ处理对照组中，Aβ降低了约75％的乙酰胆碱，而用BG101或BG201处理1周的组明显抑制了乙酰胆碱的减少(P<0.05)。图21中的各值指平均值±标准偏差。
[0203] 乙酰胆碱为从基底神经节向大脑皮层或海马发出的神经递质，从而发挥对于正常脑功能非常重要的活性(Richter等人，Life Sci.19；26(20)：1683-9(1980))。特别地，已知通过作用于乙酰胆碱系统的药物可以改变学习和记忆力。对死于阿耳茨海默型痴呆的人的研究已经表明，其乙酰胆碱能神经细胞已被严重损伤。胆碱激动剂和胆碱酯酶抑制剂已被用于患者，并且最近已知乙酰胆碱的增加通过改善认知功能和抑制痴呆发展对治疗或预防痴呆起作用。直到现在，已经开发出如卵磷酯的乙酰胆碱前体；如RS-86和尼古丁的受体激动剂；以及如他克林和爱丽赛的乙酰胆碱酯酶抑制剂，其前者已被FDA批准并在韩国上市，而其后者也在最近被FDA批准。然而，由于它们的作用不能持续长时间、较弱并且还具有严重的毒性，所以它们的使用仍易于遭受争论。
[0204] 上述结果说明，丝素肽在这里抑制脑中乙酰胆碱的降低，从而改善脑功能和抑制退化性脑疾病。
[0205] 试验实施例V：抑郁动物模型试验
[0206] 试验实施例V-1：动物试验受试者的制备
[0207] 在恒定条件(温度：25±1℃，相对湿度：60±10％)下，各箱中放入4只Sprague Dawley大鼠(140～180g，Dae Han BioLink公司，韩国)，并用没有限制的水和食物喂养1周。通过排除未发育的、在强迫游泳试验中表现出较少的运动或异常行为的个体，在上述大鼠中选择50只大鼠用于试验。
[0208] 试验实施例V-2：抑郁动物模型试验
[0209] 在该试验中使用强迫游泳试验(FST)作为用于行为绝望测试(behavioral despair test)的标准方法，其被认为是用于证明抗抑郁效力的主要试验。根据其提出者Porsolt等人(Porsolt等人，Eur.J.Pharmacol.51(3)，291-294，1978)，如下进行FST试验。
[0210] 将大鼠置于具有40cm高度和18cm直径的透明圆柱形水桶中15分钟，该桶填充有15cm深的水。尽管大鼠在最初几分钟猛烈地试图从桶中离开，但随着时间逝去，不动时间增加，并且大鼠在最后几分钟保持其身体于不动状态。不动状态一般指大鼠只推动其头到表面上并处于使其漂浮的最小运动的状态。强迫游泳试验后，将大鼠在37℃下干燥30分钟并送回到箱中。
[0211] 24小时后，在与第一次强迫游泳试验相同的条件下进行第二次强迫游泳5分钟，并测量总不动时间。由于学得无助感，与第一次强迫游泳试验相比，大鼠通常表现出更多的不动时间。如果一种药物减少了不动时间，则其被认为具有与抗抑郁功能相关的活性。因为一些药物尽管至少2周后可以获得其急性治疗和抗抑郁活性的功效，但是在 长期给药中失去其功能，所以如通常所做的，在7-天给药后进行第二次强迫游泳试验。通过记录强迫游泳的总过程并比较对照组和试验组而测量不动时间。由3个不同的分析者测量的值被平均并用作分析数据。
[0212] A.给药方法
[0213] 此处将BG101或BG201制成100mg/mL的溶液并口服给药。在第二次强迫游泳之前1小时，进行一次急性给药，并且从第一次强迫游泳之后30分钟，进行7天的长期重复给药。
[0214] B.一次急性给药的抗抑郁作用
[0215] 验证了一次急性给药(1g/kg)的抗抑郁作用。使用常规药物丙咪嗪(Sigma，美国)作为阳性对照组，并且通过参考研究结果(Eur.J.Pharmacol.138(3)，413-416，1987；Neuropharmacology28(3)，229-233，1989)，将每次给药的剂量确定为20mg/kg。图22中给出了结果。
[0216] 与对照组相比，给予丙咪嗪显著减少了平均不动时间(*，P<0.05)。另外，BG101或**BG201给药组在不动时间上也表现出显著减少( ，P<0.05)。图22中的各值指平均值±标准偏差。
[0217] C.7-天重复给药的抗抑郁作用
[0218] 验证了7-天重复给药(1g/kg)的抗抑郁作用。7天、一天一次口服给予50mg/kg的BG101或BG201，并且如前述进行试验。图23中给出了试验结果。
[0219] 与对照组相比，给予丙咪嗪显著减少了平均不动时间(P<0.05)。另外，BG101或BG201给药组在不动时间上也表现出显著减少(P<0.05)。图23中的各值指平均值±标准偏差。
[0220] 从上述结果，可以证明，与对照组相比，丙咪嗪减少了不动时间，并且BG101或BG201在统计学上也具有显著的抗抑郁活性，尽管其低于丙咪嗪的抗抑郁活性。然而，考虑到长期给药时丙咪嗪的副作用，BG101或BG201具有可以长期大量给药的优点，从而可以具有预防或治疗抑郁的优势。
[0221] 试验实施例VI：用于改善脑功能的临床试验
[0222] 将临床试验受试者分成两组：(i)试验组的67个受试者服用包括100mg此处的BG-101(″F-7″)的胶囊(BF-7200mg/天的组33个，和400mg/天的组34个)，(ii)安慰剂组的32个受试者3周、一天两次服用胶囊。
[0223] 服用胶囊之前和之后3周进行Rey-Kim测试，并评价变化。
[0224] Rey-Kim测试包括听觉言语学习测试(AVLT)和复杂图形测验(CFT)。 [0225] A.AVLT
[0226] (1)重复测试
[0227] 每秒说完单词后，要求试验受试者回忆该单词，并且总共重复5次测试。 [0228] (2)延缓回忆
[0229] 20分钟的延缓期后，要求试验受试者再次回忆单词。
[0230] (3)延缓构象(delayed conformation)
[0231] 延缓回忆测试后，给试验受试者一张纸，并要求只画出提到的单词。 [0232] B.CFT
[0233] (1)画图测试
[0234] 在测试前，给试验受试者CFT图形和一张答题纸，并要求画出图形。画完后，将CFT图形和纸放在一边，以使试验受试者不能看到它们。
[0235] (2)即时回忆测试
[0236] 在画图测试后，要求试验受试者立即画出图形。
[0237] (3)延缓回忆测试
[0238] 20分钟的延缓期后，要求试验受试者再次画出图形。
[0239] (4)CFT的评价
[0240] 根据CFT评价标准，鉴于其形状和位置，以0～2分评价18项目的每一个。因此，每个测试可以得到0～36分。
[0241] C.评价项目
[0242] ①记忆商数(MQ)：记忆能力的最直接的反射指数。
[0243] ②记忆保持：表明记忆被准确地保持多少和如何的指标。
[0244] ③回忆效率：表明利用记忆的准确和有效程度的指标。
[0245] ④画图/记忆力一致性：用于确定画图能力或记忆力是否引起改善的画图结果的指标。
[0246] ⑤智力/记忆力一致性：表明智力提高和记忆力提高之间的关系的指标。 [0247] D.数据的统计分析
[0248] 使用配对t-检验分析给药之前和之后得分的差值。使用ANOVA确定安慰剂组、BF-7200mg组和BF-7400mg组之间的得分差值是否具有统计学显著性。
[0249] E.结果
[0250] (1)由BF-7提高的MQ
[0251] 安慰剂组、BF-7200mg组和BF-7400mg组给药前和后的MQ之间的差值分别为3.1、11.6和20.6。该结果说明，三种情况都表现出明显改善，且改善与BF-7剂量成比例(图
24)。对于安慰剂组、BF-7200mg组和BF-7400mg组，MQ分别从106提高到110，从106.5提高到118，和从106提高到126(图25)。
24)。对于安慰剂组、BF-7200mg组和BF-7400mg组，MQ分别从106提高到110，从106.5提高到118，和从106提高到126(图25)。
[0252] (2)由BF-7提高的回忆效率
[0253] 较高的百分数得分意味着更好的回忆效率。BF-7200mg组和BF-7400mg组分别表现出从31％至58.9％和从41.5％至66.5％的明显提高，而安慰剂组没有表现出明显提高(图26)。
[0254] (3)由BF-7提高画图/记忆力一致性
[0255] 当百分数得分较低时，画图结果更多归因于较低的记忆力。BF-7200mg组和BF-7400mg组分别表现出从36.8％至56.5％和从24.7％至65.2％的明显提高，而从38％至40％的安慰剂组没有表现出明显提高(P>0.05)，这说明智力的提高不是由于画图能力的提高，而是由于记忆力的提高(图27)。
[0256] (4)由BF-7提高的智力/记忆力一致性
[0257] 较高的百分比得分意味着在具有相似智力的相同年龄的人中具有较好的记忆。如图28中所示，安慰剂组和BF-7200mg组分别表现出从55.5％至63.4％和52.9％至78.9％的明显提高。BF-7400mg组表现出从52.5％至91.9％的显著提高(P<0.05)。
[0258] (5)由BF-7提高的记忆保持
[0259] 较高的百分比得分意味着更好的记忆保持。安慰剂组和BF-7200mg组没有表现出明显提高(P>0.05)，而BF-7400mg组表现出从53.2％至61.3％的明显提高(图29)。 [0260] 如上所述，从给药前和后MQ之间的差值可以证实，安慰剂组、BF-7200mg组和BF-7400mg组这三种情况都表现出智力的明显提高。如已经报道的，尽管安慰剂组的提高可能是由于宽范围的标准偏差，并且在某种程度上是由于心理效应，但是可以得出BF-7具有提高智力的活性的结论。
[0261] 另外，从BF-7还提高了如记忆效率和画图/记忆力一致性的其它指标的事实来看，也可以得出BF-7有助于提高回忆能力、记忆和学习能力，并且有效地作用于如痴呆的神经退化性疾病的结论，因此是具有很多科学和工业用途的非常珍贵的物质。
[0262] 如上所述，本发明提供了一种有效地制备具有神经保护活性和能促进身体吸收的低分子量的丝素肽的方法。
[0263] 另外，本发明提供了一种包括这样制备的丝素肽的用于预防或治疗脑疾病或者改善脑功能的组合物。本发明的组合物表现出如详细描述中所阐述的活性或作用，并且由于其包括天然物质丝素肽作为活性成分，所以对人体具有非常低的副作用。
来源：专利汇
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蚕丝蛋白有多牛？ – 细胞优化-我们重定义年轻 · February 17, 2019 at 2:41 pm
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